Die Serie dreht sich um das abenteuerliche Leben der Spezialagentin Sydney Bristow (Jennifer Garner), die lange Zeit glaubt, dass ihr Auftraggeber SD-6 eine geheime Unterabteilung des CIA ist. Doch nachdem Sydney ihrem Verlobten ihr bis dahin geheimes Agentenleben offenbart hat, wird dieser vom SD-6 getötet und sie selbst als Sicherheitsrisiko eingestuft. Unerwartete Hilfe bekommt sie von ihrem Vater, der ihr erklärt, ebenfalls für den SD-6 zu arbeiten, und dass es sich bei dieser Organisation um Verbrecher und Staatsfeinde handelt. Er entpuppt sich als Doppelagent, der dem CIA wichtige Informationen zuspielt. Es gelingt Sydney, dem SD-6 durch den Diebstahl eines wertvollen Artefaktes ihre Loyalität zu beweisen, und fortan arbeitet sie mit ihrem Vater und der CIA zusammen, um das Verbrechersyndikat zur Strecke zu bringen. Dabei muss sie für den SD-6 auf der ganzen Welt gefährliche Missionen erledigen und stets aufpassen, dass ihre Verbindung zum CIA nicht aufliegt.

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